中国科学家利用诱导多能干细胞（iPS细胞）培育出的克隆猪。（刘通宇/图）

绝大多数克隆动物在胚胎发育的早期即告流产，中美两国科学家的一项最新研究表明，与胚胎发育相关的一个重要基因的沉默是哺乳动物早期流产的关键原因，这一发现也为解决人类自发流产难题提供了新思路。

2018年11月1日，《美国科学院院刊》（PNAS）在线发表了中国和美国科学家的最新研究成果，揭示了一个与胚胎发育相关的重要基因RTL1的沉默是哺乳动物早期流产的关键原因；通过RTL1基因的补偿表达，可显著提高诱导多能干细胞（iPS细胞）克隆动物的繁殖效率，也为解决人类自发流产难题提供一个新的思路。

克隆动物易流产

经过基因改造的克隆猪，可为人类提供续命的器官，也可精准模拟人类遗传病或癌症，以便科学家弄清楚这些复杂疾病的致病机理，或用以验证新药，已成为生命科学研究中最令人期待的热门领域之一。

一般情况下，克隆猪是由体细胞经过核移植操作培育出来的，不过基因修饰克隆猪则先需要对体细胞进行多次复杂的基因操作，绝大多数体细胞比较脆弱，寿命短，难以承受反复“折腾”，因此利用体细胞很难培育出符合人们期望的基因修饰克隆猪，这正是目前该研究领域的主要难点之一。

2006年，日本科学家山中伸弥教授团队向小鼠的一种皮肤细胞——成纤维细胞中转入四个转录因子基因，使得已高度分化的体细胞重新获得全能性，即可分化成体内的任意一种细胞，包括神经细胞和生殖细胞等，这种干细胞就是诱导多能干细胞。山中伸弥教授也因为这一发现，与体细胞克隆技术的主要发明人、英国生物学家约翰·格登教授一起分享了2012年诺贝尔生理学或医学奖。

目前，国际上与iPS细胞相关的大多数研究成果均集中在小鼠身上，而利用猪、牛、羊等大动物的iPS细胞培育出健康克隆动物则鲜有报道。2012年12月，在中国农业大学李宁院士领导下，全国十几家科研单位集中攻关，首次在国际上利用猪的iPS细胞培育出克隆猪。之后，国际上再无iPS细胞克隆猪诞生，更没有iPS细胞克隆牛、羊等其它大动物的消息。

为什么iPS细胞克隆大动物如此难以培育呢？研究表明，iPS细胞核移植囊胚发育率可达10~30%，与体细胞克隆差不多，但是将这些源自iPS细胞的克隆胚胎移植到代孕母畜体内后，绝大多数克隆胚胎在胚胎发育的早期即告流产。

大量的动物研究数据表明，体外生产的胚胎相比体内胚胎都具有更高的流产率。例如，自第一只体细胞克隆哺乳动物多利绵羊诞生20多年以来，已有20多种哺乳动物得到克隆后代，包括2018年初中国科学院神经科学研究所培育的世界首例体细胞克隆猴，但是体细胞克隆技术的流产问题一直没有得到显著改善，不同动物的克隆胚胎流产率均在90%以上。

流产的关键原因

研究发现，表观遗传修饰的异常被认为可能是导致哺乳动物流产的一个重要原因，尤其是辅助生殖技术过程中胚胎的体外培养和相关操作会导致甲基化修饰等表观遗传修饰异常，从而引发流产。

这是因为动物发育过程是从单细胞受精卵，发育成胚胎干细胞，干细胞进一步分化成各种功能的体细胞，后者再组成各种组织器官。尽管同一动物内每个细胞的基因组都完全一样，但是控制细胞分化和发育的基因因为受到某些表观遗传修饰，包括甲基化修饰、组蛋白修饰、基因印记、X染色体失活等，从而表现出不同的命运。如果说基因组决定细胞能表达什么样的功能蛋白，那么表观遗传修饰则决定了每个基因什么时候表达，表达水平高低等，后者就像给不同的胚胎细胞提前设置了“指令”，当胚胎细胞接到的“指令”是发育成神经细胞，那它只能发育成神经细胞，如果“指令”是心肌细胞，那它也只能发育成心肌细胞，如此，这些胚胎细胞会按照各自的“指令”发育成各种不同的组织器官。

体细胞克隆和iPS细胞克隆等体外辅助生殖技术都涉及已高度分化的体细胞，要让这些体细胞能发育成动物个体，重新恢复类似胚胎干细胞的全能性，则需要让这些细胞“恢复出厂设置”，使一些细胞分化关键基因的表观遗传修饰模式得以逆转，但是有些基因的表观遗传修饰比较顽固，致使这些基因表达异常，最终导致动物流产。到底哪些基因在“捣乱”呢？

为了找到哺乳动物流产的主要原因，来自中国农业大学的吴森教授、赵要风教授、杜旭光博士团队与2007年诺贝尔生理或医学奖获得者、美国犹他大学MarioCapecchi教授合作，以猪iPS细胞克隆胚胎作为实验对象，建立了研究哺乳大动物早期流产的模型。中科院动物所北方大动物研究基地、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、重庆市畜牧科学院等单位的科学家也参与了这项工作。

中美研究人员首先从猪的胎儿皮肤组织分离出成纤维细胞，借鉴山中伸弥的方法，向猪成纤维细胞加入四种转录因子，诱导其发育成多能干细胞，并通过核移植获得克隆胚胎。但是，当研究人员将这些克隆胚胎移植到代孕母猪子宫内后，流产率接近100%，特别是在早期妊娠（25-45天）阶段，流产率高达90%以上，显示胚胎发育早期是克隆胚胎能否发育到期的关键期，而体细胞克隆胚胎则能获得健康存活的仔猪。

RTL1是逆转录转座子衍生蛋白，对于哺乳动物胚胎微血管和胎盘形成至关重要，而且在正常胚胎发育后期表达水平会随之提高，但是这些流产克隆胚胎RTL1含量却显著偏低，甚至检测不到。研究人员不仅在猪的克隆胚胎发现这一现象，在牛的体细胞克隆和体外受精胚胎中也发现了类似现象，这表明RTL1基因表达异常是哺乳动物流产的关键原因。

为了证明上述推论，研究人员进行了RTL1基因敲除和补偿表达试验。当利用基因编辑技术将iPS细胞的RTL1基因敲除时，这些iPS细胞克隆胚胎移植到代孕母猪体内后无一发育到出生；当将RTL1基因转入这些iPS细胞克隆胚胎中，让其表达RTL1蛋白以填补细胞内该蛋白的空缺，结果显示，这些RTL1得到补偿的iPS细胞克隆胚胎可成功发育出克隆小猪，克隆猪的出生存活率与体细胞克隆的效率相当，远远高出之前iPS细胞克隆猪出生率；而未转入RTL1基因的iPS细胞克隆胚胎则全军覆没。这些研究进一步证明，RTL1基因的表达异常是克隆动物容易流产的关键原因，同时也为解决哺乳动物甚至人类的流产问题提供了较好的思路。

或为人类流产提高解决方案

随着我国人口政策的调整，预计在未来几年内我国新生儿的数量将会出现大幅的增长，但是随之而来的产妇高龄化、环境污染及工作压力引起的男性精子活力低等现实问题，导致受精胚胎在植入后时期发育阻滞的概率大大增加。据国家卫生健康委员会数据显示，从不同地区、不同阶层及不同年龄的取样分析，自然流产的发生率在15%-40%，约75%发生在妊娠16周以前，发生于妊娠12周前者占62%。也就是说，在人类的妊娠终止事件中约有三分之二的胚胎在三个月前发生自发流产。

其实，人类辅助生殖技术也面临同样的流产难题。自1978年第一个试管婴儿诞生以来，体外受精（IVF）、卵胞浆内单精子注射（ICSI）、胚胎移植等辅助生殖技术已在全球培育出超过650万个试管婴儿。据一份商业咨询报告显示，2016年-2024年，全球试管婴儿需求量复合年增长率将保持在6%以上。

但是，体外受精等辅助生殖技术仍然存在一些问题，如出生存活率偏低。据美国繁殖医学协会最新数据显示，美国体外受精胎儿出生成活率约为37%，这与年龄有较强的负相关，如35岁以下孕妇的胎儿出生成活率可达54%，而42岁以上孕妇的胎儿出生成活率不到4%，出生存活率随着孕妇年龄增长而下降。

有趣的是，研究人员分析发现，人类妊娠早期自发流产胚胎的RTL1含量偏低，同时他们还注意到RTL1基因的表达会随着母亲年龄的增加而降低。此外，超过10%的男性不孕患者精子在RTL1基因及周边序列存在异常的DNA甲基化模式。所有这些导致人类胚胎流产的数据都支持了该研究的假设，即RTL1基因可能是人类自发性流产的重要表观遗传决定因素。

通过进一步研究RTL1的作用机制和调控网络，有可能开发出针对RTL1基因靶点的药物，将有望降低孕妇的自发流产率，为日益增多的高龄孕妇及家庭带来新的希望。