1.基因敲除小鼠

1）构建具有干扰基因的干细胞

首先克隆一段含有待敲除的小鼠基因的DNA，然后用新霉素抗性基因插入其中，断开这一靶基因，在克隆基因的其他部位（靶基因之外）引入一个胸苷激酶基因，这两个额外基因将用于后面剔除未发生定向敲除的克隆子。

接下来将构建小鼠的DNA与褐色小鼠的胚胎干细胞混合，这些干细胞可以分化成任何类型的小鼠细胞，在其中一小部分细胞中，被断开的基因通过某种途径进入细胞核，并于细胞中同源的野生型靶基因之间发生同源重组，从而使断开的靶基因能够进入小鼠基因组中，并移去胸苷激酶基因，最后通过新霉素衍生物G418杀死无新霉素抗性的细胞，即未发生同源重组的细胞，除了同源重组外，还可能出现非同源重组产生带有随机插入的断开靶基因与胸苷激酶基因的细胞，此时通过丙氧鸟苷可以杀死杀死含有胸苷激酶基因的细胞，最后只留下发生同源重组的细胞。

2）第二阶段，将断开基因置入动物体内

2.转基因小鼠

一般采用两种方法，第一种，直接将克隆的外源基因注射到精子的细胞核中，此时精细胞和卵细胞刚受精，精卵细胞的核尚未融合，由此允许外援DNA自行插入到胚胎细胞的DNA中，通常以成串的重复基因形式插入，这种插入是在胚胎发育的很早期发生的，但是即使只有一两个胚胎细胞发生了分裂，在产生的成年个体中就会有一些细胞不含转入基因，这一个体就是嵌合体，因此，接下来的步骤就是将这些嵌合体与野生型小鼠杂交，挑选带有转基因的鼠仔。

带有转入基因说明它们是从带有转入基因的精子或卵细胞分化而来的，因此它们体内的每一个细胞都会含有转入基因，这些就是真正的转基因小鼠了。

另一种办法是将外源DNA注射到胚胎干细胞中，产生转基因ES细胞，这些ES细胞可以像正常胚胎细胞一样发育，因此，如果转基因ES与早期正常小鼠胚胎混合，它们就开始分化，并伴有正常胚胎细胞，结果产生嵌合体，其中一些细胞含有转基因，另一些则没有，随后将嵌合体与野生型小鼠杂交，得到真正的转基因鼠仔。

Ref:《分子生物学》RobertF·Weaver著